來源：西安海研生物科技公司 發(fā)布時間：2019-03-27
摘要：由于傳統(tǒng)方法在檢測水中大腸菌群和大腸埃希氏菌需要48小時左右,且操作過程復(fù)雜,難以掌握?，F(xiàn)介紹一種快速簡便的檢測方法，根據(jù)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 5750-2006）中推薦的固定底物技術(shù)酶底物法可購買到市售化產(chǎn)品西安海研生物科技有限公司的Colitech試劑。用于檢測100ml水樣，只需手工操作2分鐘，即可在24小時內(nèi)同時定量檢測出大腸菌群和大腸埃希氏菌。此方法大大的減少了工作量，避免了使用多管法的逐級稀釋帶來的操作誤差；也避免了使用濾膜法時肉眼讀數(shù)的人為誤差，所以其假陽性率和假陰性率都比傳統(tǒng)方法低。由于24小時內(nèi)就得到結(jié)果，可以很好的用于突發(fā)事件應(yīng)急。
1. 背景：
目前我國對生活飲用水、水源水、地表水等進行衛(wèi)生學(xué)評價，檢測的指標(biāo)為大腸菌群和大腸埃希氏菌或糞大腸菌群（耐熱大腸菌群），以這些指標(biāo)作為糞便污染的指示菌。采用的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法為膜過濾法和多管發(fā)酵法。但這兩種方法檢測時間相對較長，需48—72小時，需驗證試驗，試驗步驟較為繁瑣，所以不能對水的衛(wèi)生學(xué)狀況做出快速評價。因此，采用快速簡便的檢測方法很必要。固定地物技術(shù)酶底物法可以較好的彌補傳統(tǒng)方法的不足。
主要內(nèi)容：
1、實驗原理
2、儀器設(shè)備與試劑耗材
3、實驗步驟
4、討論與分析
2. 原理：
固定底物技術(shù)酶底物法（Defined Substrate Technology）采用大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培養(yǎng)液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下產(chǎn)生熒光的原理，來判斷水樣中是否含有大腸菌群及大腸埃希氏菌。固定底物技術(shù)酶底物法可以選用國標(biāo)中推薦粉狀培養(yǎng)基（西安立科公司的酶底物試劑）來進行簡便的操作；無需確認(rèn)試驗；固定底物技術(shù)酶底物法檢測時間短，只需24小時即可同時定量出水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌的MPN值。
3. 試劑和設(shè)備：
3.1 試劑：采用固定底物技術(shù)酶底物法市售化的MMO-MUG（Minimum Media ONPG-MUG）培養(yǎng)基—酶底物試劑。
3.2 耗材：取樣瓶或使用滅菌的玻璃；51孔定量盤或97孔定量盤。
注：51孔定量盤可在無需稀釋的情況下檢測1—200個目標(biāo)菌/100ml水樣；97孔定量盤可在無需稀釋的情況下檢測1—2419個目標(biāo)菌/100ml水樣。
3.3 設(shè)備：定量程控封口機；366nm紫外燈；陽性對照物 。
注：海研sea plus定量程控封口機除了將定量盤進行封口外還對100ml水樣平均分配到51個孔或者是97個孔中。
4. 操作方法：
4.1 定性檢測：
4.1.1 適用范圍：
一般用于檢測飲用水、瓶裝水等；這些水樣的結(jié)果是不得檢出。所以只需用定性檢測就可滿足試驗要求。
4.1.2 操作步驟：
1) 將一個酶底物試劑倒入裝有100ml水樣的無菌取樣瓶或無菌玻璃瓶中，混勻。
2) 放在36±1℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時；
注：如檢測耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）則需放在44.5℃，培養(yǎng)24小時；如果培養(yǎng)時間超過28小時，則陰性結(jié)果則結(jié)果有效，如果為陽性結(jié)果則結(jié)果無效，需重做此水樣。
3) 根據(jù)下面的結(jié)果解釋讀取結(jié)果
4) 無需確認(rèn)試驗
4.2 定量檢測
4.2.1 適用范圍：適用于任何一種水體。
4.2.2 操作步驟：
1) 將一個酶底物試劑倒入裝有100ml水樣的無菌取樣瓶或無菌玻璃瓶中，混勻。
2) 將瓶內(nèi)的水樣全部倒入51孔或者是97孔定量盤中，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，然后使用定量程控封口機進行封口。
3) 將定量盤放在36±1℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時 。
注：如檢測耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）則需放在44.5℃，培養(yǎng)24小時；如果培養(yǎng)時間超過28小時，則陰性結(jié)果則結(jié)果有效，如果為陽性結(jié)果則結(jié)果無效，需重做此水樣。
4) 根據(jù)下面的結(jié)果解釋讀取結(jié)果。數(shù)出陽性格子數(shù)后對照MPN表得到結(jié)果。
5) 無需確認(rèn)試驗
5. 測量范圍
5.1 最低檢出限酶底物試劑可以在24小時同時檢測出總大腸菌群和大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌群（糞大腸菌群），它可以在100ml水樣中抑制2百萬個雜菌干擾，最低檢出限為每100ml水樣可檢測出1cfu的總大腸菌群，大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）。
5.2 選用51孔定量盤
在不稀釋的情況下，100ml水樣可檢測200個總大腸菌群，大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）。
5.3 選用97孔定量盤
在不稀釋的情況下，100ml水樣可檢測2419個總大腸菌群，大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）。
6 檢測水樣的范圍
飲用水 、源水 、瓶裝水 、中水 、二次供水 、管網(wǎng)水 、廢水 、食品水 、畜牧用水 、醫(yī)療用水
7．實驗過程中需注意的地方
如果樣品有背景顏色，請做一個空白實驗，與結(jié)果相比較，如果樣品被稀釋，則在讀取MPN表時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，只可使用純水，不含緩沖的水，不含氧化劑的水進行樣品稀釋，如果樣品中含有過多的氯，則在加入試劑時會顯藍光，此時樣品應(yīng)被終止檢測。
8．結(jié)論
總大腸菌群細(xì)菌主要由以下4個菌屬細(xì)菌組成：埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬。這些菌屬可以在人、畜糞便中檢出，有的也可以在營養(yǎng)豐富的水體中檢出，即非糞便污染的情況下，也有檢出這些細(xì)菌的可能性。糞大腸菌群組成與總大腸菌群組成相同，但主要組成是埃希菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關(guān)的僅有一個種，即大腸埃希氏菌；檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬所占數(shù)量較少。作為糞便污染的指示菌，大腸埃希氏菌檢出的意義很大，其次是糞大腸菌群，總大腸菌群的檢出意義略差一些， 固定底物技術(shù)酶底物法操作簡便，檢測時間短，可在24小時內(nèi)同時檢測水中大腸菌群和大腸埃希氏菌的污染狀況且無需確認(rèn)試驗；減少了傳統(tǒng)方法中人為操作的誤差，能夠更準(zhǔn)地判斷水樣的微生物污染狀況；作為飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的新方法，不但可以用于水樣的例行檢測，更可作為應(yīng)急突發(fā)事件的必備試劑。
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